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三維細胞培養技術發展及醫學研究應用

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摘要:三維細胞培養(Three-DimensionalCellCulture,TDCC)允許體外腫瘤細胞在各個方向上生長,可以在細胞基因表達、基質分泌及細胞功能活動等方面更好地模擬體內細胞狀態。TDCC既保留體內細胞的形態,又體現細胞培養的直觀性及條件可控性,為進一步研究腫瘤細胞特征提供了良好的平臺,特別是在轉化醫學、藥敏研究等關鍵領域。TDCC將傳統2D細胞培養與動物實驗模型相結合,取精用宏,為推進腫瘤細胞生物學研究發揮舉足輕重的作用。本文著重論述TDCC技術在醫學研究中的應用,包括腫瘤藥理學、干細胞和類器官模型的臨床應用及生命科學研究領域的應用,為臨床及基礎研究工作者提供理論依據與參考。

關鍵詞:三維細胞培養(TDCC);藥理學;干細胞;臨床應用;細胞外基質 

1三維細胞培養的前世今生

細胞培養技術的萌芽可以追溯至1885年,德國科學家WillhelmRoux成功分離雞胚細胞并用鹽水培養數日[1-2]。1943年,Earle等創建了單層細胞培養法,首次創建長期傳代的L-細胞系,五年后,Sanford使用細胞分離培養法獲純L-細胞系[3]。隨著雙抗、胰蛋白酶的應用,體外細胞培養技術日升月恒,具有易操作、成本低等優點,細胞在很長一段時間內可以無限增殖和分化,但其生長發育的環境和條件與體內差異較大,這就導致細胞的基因表達和形態特征與體內差異較大,得出的實驗結果并不能一一在動物體內得到重復。上世紀80年代,Weaver等對細胞與ECM間的關系進行了系統性總結,在對乳腺癌細胞的研究中構建出TDCC模型,并觀察到單層管狀腺泡樣結構的正常乳腺上皮細胞及腺泡結構的碗狀的癌變上皮細胞[4],三維培養技術運勢而生,正式登上歷史的舞臺,嶄露頭角。本世紀初Jacks和Weinberg[5]和Abbott[6]發表了使用MatrigelTM與海綿凝膠混合基質進行組織培養,形成了疑似三維構造的細胞團。同年,Amann團隊[7]描述了使用非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系與肺成纖維細胞組合的新型3D共培養模型。通過對比研究,證明了該模型更接近體內細胞生長微環境,能更好地反映腫瘤-基質相互作用。Young等[8]總結了前人的經驗,借組織輥(TRACER)平臺(生成的生物復合材料卷繞在心軸周圍以產生3D和分層結構)將癌癥相關成纖維細胞(CAF)和下咽鱗狀細胞(FaDu)細胞進行共培養,發現在培養物的24和48h確實產生了增殖速率和侵襲性細胞遷移的增加。為研究腫瘤-基質相互作用以及新型TDCC模式提供了基礎。近年腫瘤基礎實驗研究中,TDCC技術已得到越來越多的關注。

2在腫瘤藥理學研究中的應用

Souza團隊[9]利用2D和磁性3D生物打印系統培養并用抗腫瘤藥物紫杉醇和多西紫杉醇評估了前列腺腫瘤細胞系PC-3,LNCaP和DU145的增殖、基因表達、化學抗性和細胞毒性差異,TDCC物顯示出較低的細胞增殖率,對紫杉醇和多西紫杉醇更大的抗性以及發生了基因表達譜的改變。藥物誘導的肝損傷是制藥工業中與安全相關的磨損的主要原因。研究者們也在不斷突破肝細胞系和原代肝細胞這些2D肝臟模型的局限性,繼續尋找更切合體內實際的體外模型。3D肝臟模型的出現,包括球狀體,3D生物打印的肝臟和肝臟上芯片,徹底改變了體外肝臟毒性測試。這些模型被統稱為微生理系統(MPS)。該模型可以在培養物中維持至少1個月,在此期間保持顯著的藥物代謝能力。一些MPS模型也可以與其他非實質支持細胞共培養,例如內皮細胞,庫普弗細胞和星狀細胞,這增加了毒性評估模型的多功能性。TDCC表現出與體內系統更相似的行為,是新藥研發最有前途、更為可靠的工具。

3干細胞和類器官模型的臨床應用

具有廣泛來源和多能分化的人多能干細胞(hPSCs)被認為是組織修復和重建領域的后起之秀。然而,傳統的貼壁培養改變了hPSCs的初始生長環境,導致自我分化、衰退、形態學甚至基因表達等改變,三維球體培養在促進hPSCs的生物活性中起著重要作用。Nachlas等[10]用透明質酸和聚N-異丙基丙烯酰胺組成的熱響應性3D水凝膠對hPSCs進行培養,這種具有調節化學和機械性質能力的系統易于在低溫下與細胞混合,在37℃時在水凝膠內進行物理包封,保持細胞多能性,其分化增殖能力得到加強。Sasagawa團隊[11]試圖使用臍帶血衍生的內皮祖細胞的亞型,具有強烈的增殖和血管生成潛力的內皮細胞集落形成細胞(ECFC)制造血管前體,并評估這些構建體的體內血管生成潛力。人臍帶血管內皮細胞(HUVEC)也用于與ECFC比較,ECFC使用纖維蛋白包被的細胞片操縱器夾在衍生的成纖維細胞(FB)片之間。將雙層FB片中插入的ECFC培養3d,導致形成與HUVEC類似的網絡結構。另外,當ECFC夾在3個FB片材中時,在共培養后3d在3層細胞片構建體中發現了管腔結構。將含有ECFC的這些構建體移植到免疫缺陷大鼠的皮下組織中,1周后,與HUVEC陽性移植物相同的方式觀察含有大鼠紅細胞的ECFC的功能性微血管,表明ECFC可能成為3D細胞密集組織構建體中制造血管前結構的替代細胞來源而在臨床得到廣泛應用。

4生命科學研究領域的應用

業已證實,3D培養的細胞比二維貼壁細胞具有更多的生理學相關功能。隨著腫瘤與其微環境之間相互作用的復雜性變得越來越明顯,迫切需要設計能夠真實地概括3D微環境和相關細胞群的體外模型。細胞在復雜的體內微環境中被細胞外基質(ECM)三維包裹,并與ECM和相鄰細胞相互作用。因此,復制ECM環境是細胞培養模型成功的關鍵。已有多項研究基于物理、化學和生物特征(例如生物相容性,生物可降解性和生物化學官能團)使用各種天然和合成水凝膠來模擬ECM環境,由于這些特性,水凝膠可與微流控技術結合并在芯片上構建3D系統,同時可控制所選水凝膠的孔隙率以促進營養素和氧氣的移動,近乎完美地模擬了體內微環境[12]。骨肉瘤(OS)是最常見的骨原發性惡性腫瘤,優先發生肺轉移。盡管標準化療在過去幾十年中顯著改善了長期存活率,但轉移性或復發性OS患者的預后仍然非常差。因此,需要新的療法來減緩進展并根除疾病。此外,為了更好地理解導致OS發作和進展的細胞和分子機制,亟待開發類似于天然三維腫瘤微環境的新型培養系統。Angela等[13]總結了TDCC的最新技術,并報告所取得的成果,突出了這些模型在再現腫瘤環境中的功效,其中建立的3DOS球體模型被認為是腫瘤研究中最具生理學相關性的三維模型[14]。然而,由于材料的選擇,制造工藝以及需要同時支持硬組織和軟組織和多種細胞群的最佳條件,使得骨腫瘤3D建模仍然是一項艱難的嘗試。

5結論與展望

當下,TDCC作為一項新興的細胞培養技術,已從單純的懸浮成球演變到微流控、芯片、組織工程支架和3D打印培養,無不證明TDCC將在未來臨床醫學及基礎研究中起到扮演越來越重要的角色。然而,TDCC尚存一定的局限性:首先,繁瑣的制備步驟及昂貴的成本限制了其推廣;其次,有限的分化程度和生存能力阻礙了TDCC的發展。因此,我們應積極采取措施,(1)用納米技術等更高新的材料和加工技術,讓培養系統的各項參數可控可調。(2)與不同類型的生物反應器結合,如與流式生物反應器結合,來解決三維培養中代謝產物或者藥物運動擴散受限的情況;(3)以此為平臺建立多種細胞共培養體系,如腫瘤細胞+免疫細胞+內皮細胞共培養等,以明確腫瘤細胞與基質及其他相鄰細胞之間同時作用的影響。為此,未來TDCC技術的發展需要醫學,生物科學、材料和高分子化學、物理學、儀器制造業等許多領域的跨學科協作發展,以上這些都將更好地模擬體內腫瘤細胞真實的微環境情況,有助于我們得出更準確的科學結論,助力精準醫療。

作者:余坤 周永春 單位:昆明醫科大學第三附屬醫院

三維細胞培養技術發展及醫學研究應用責任編輯:張雨    閱讀:人次
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